主题颜色

氡暴露致肺癌相关基因研究的进展

  氡是地壳中的铀的天然衰变产物,普遍存在于环境空气中。近年来,随着建筑材料的广泛应用,普通人群对氡的接触机会和暴露水平明显增加。主要的职业性氡接触人群是铀矿工。矿工吸入高浓度氡(222Rn)会增加患肺癌的危险性。利用矿工模型的外推表明,氡是第二位致肺癌的因素。德国7%的肺癌、荷兰4%的肺癌、瑞典4%的肺癌以及美国的10%~15%的肺癌由氡暴露引起。为了证明这些估计的可靠性,许多国家进行了居室内氡暴露与肺癌关系的流行病学研究。目前认为居室氡暴露可能导致患肺癌的危险性增加,主要根据从高浓度接触氡矿工的研究结果的外推,尚缺乏直接的生物学证据和分子流行病学调查资料证实。随着肿瘤分子生物学研究的发展,对肺癌基因的研究已较透彻,确定了许多与肺癌相关的基因,显性基因如ras家族(H-ras、N-ras、K-ras)、myc家族(c-myc、Lmyc、N-myc)、erbB家族(erbB、1erbB2/Her~2/neu);隐性基因如p53基因、Chr3p、Chr5p13~5q14、Chr9p21~9q、视网膜母细胞田基因(Rb),其他基因如raf基因(C-ral-Ⅰ)、jun家族(c-jun、junB)src家族(src、lck)、视黄酸受体基因(RARα、RARβ、RARγ)、磷酸酶(磷酸酪氨酸磷酸酶)等。自20世纪90年代以来,人们陆续研究氡辐射致肺癌的相关基因,如p53、K-ras、p16、6-氧-甲基嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-MGMT)和hprt基因,试图寻找氡致肺癌的特异性分子标志物。

  一、p53基因

  p53基因发现于1979年,它位于17p13.1,是一个重要的肿瘤抑制基因,其编码一种相对分子质量为53000的磷酸化核蛋白,全长20kb,由11个外显子组成。P53分为野生型和突变型。正常组织细胞中,p53为野生型,参与细胞G0~G1期的负调节,从而调控细胞的生长、分化,控制细胞增殖,抑制癌细胞生成;突变型p53基因抑制野生型p53的活性,破坏其对细胞生长、分化的负调控作用,促进癌细胞增殖。在数种类型的肺癌中,都发现了p53基因的缺失、重排或突变。突变是非随机的,多发生于外显子5~8的4个高度保守区(117~142、171~181、234~258、270~286位氨基酸残基)。

  不同致癌物可留下其特殊印迹(fingerprint)。Taylor等在分析受高浓度氡辐射的矿工肺癌时发现,p53基因第7外显子的249密码子发生AGG(精氨酸)→ATG(甲硫氨酸)的颠换。他认为此位点是辐射诱发肺癌的标记物。但在其后多项研究都不支持有氡特异p53热点突变的存在。Popp等在研究氡致肺癌p53突变图谱时发现,G→T颠换的p53突变在氡暴露引起的肺癌中有多见,他认为p53基因只能是氡致肺癌早期突变基因,以前过度夸大了p53第3外显子213位密码子多态性在氡致肺癌中的作用。Yngveson等认为居室内氡暴露似乎与肺癌p53基因较高的突变率有关联。夏英等报道,接触氡在200~350Bq•m-3•a-1范围内的7例肺癌病例中,有5例发生了p53基因突变(p53基因突变还可能与肺癌患者的年龄及吸烟史有关)。他们发现,有2个样品出现G→A碱基颠换突变,突变位置分别为第8外显子的273位密码子和第5外显子的141位密码子;1个样品在209位密码子出现A→T转换突变,编码精氨酸被置换为终止密码子。随后他们应用PCR扩增、聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和mRNA差异显示方法,从高氡暴露地区居民肺癌组织和正常肺组织中选出有表达差异的基因片段标本进行PCR-SSCP)电泳,结果呈阳性。其中3例经克隆测序发现有碱基置换。经反向Northern blot杂交,将肺癌组织表达呈阳性的片段而正常肺组织呈阴性的片段进行克隆测序。结果7条差异片段经克隆测序后,其中NA7与GenBankEST中的AI208667序列同源性达95%以上;NG2与5条基因序列同源性高达98%;CA1与任何已知基因片段的开放阅读框架同源性都小于70%。人为CA1可能是一个新的差异基因片段。但其同肿瘤的相关性需要进一步的实验证实。杨梅英等以云南锡矿工肺癌切除的癌组织和正常肺组织为样品,用差异显示法比较两种组织差异表达基因,并将其克隆测序。结果在同一患者的肺癌组织和正常肺组织中发现有30个表达差异的基因片段。其中,16个片段仅在肺癌组织中表达而不在正常组织中表达;14个片段仅在正常组织中表达而不在肺癌组织中表达。测定了6个片段的序列,CG2、CG7、CG8、CA5和C C等65个序列在GenBank中未查到有75%同源的序列,被认为是新序列,并在GenBank中登录;CG3与人核糖蛋白127a有95%的同源性。

  Schneider等研究发现,原癌基因表皮生长因子受体EGF-R、P53蛋白和P53抗体可在一些氡暴露致肺癌患者中检测到。这些表达产物可以能过酶联免疫吸附试验检测,所以可作为分子标志物用于氡致肺癌的分子流行病学调查。但他们未发现这些表达产物在不同肺癌的病理组织学类型、不同年龄、不同暴露程度的肺癌患者血清中有明显升高或降低的现象,所以限制了这3种表达产物作为常规的生物标志物在氡致肺癌分子流行病学调查中应用。Lutz等述及p53基因突变和表达异常产物可作为氡致肺癌发生发展过程的基础,同样都可作为监测基因操作和蛋白合成的分子标志物用于流行病学调查中。p53基因发生突变是癌症发展中的必需过程,p53基因的表达异常和基因突变也引起细胞内P53蛋白水平改变,细胞外液和血液中的P53蛋白水平随之升高。所以血液中血清蛋白P53水平的升高可作为肺癌早期诊断指标。大量的研究结果表明,随着变异型和野生型的P53蛋白的增加,P53抗体相继产生。统计分析表明,P53抗体可认为是癌症发展中特异性的生物标志物,其水平的升高与p53基因的突变频率及癌症的恶化程度有关。

  二、K-ras基因

  K-ras基因位于第6和第12号染色体上,属ras基因家族。Ras基因是原始保守的基因。Ras家族编码相对分子质量21000的GTP/GDP结合蛋白P21。P21蛋白与G蛋白有关,在细胞生长刺激信号的传递和细胞生产调节中起作用。P21接受其上游信号分子传递的生长与分化信号,通过下游效应分子控制细胞的生长与分化。Ras基因激活机制有三:(1)点突变。最终有利于P21蛋白与GDP结合,导致信号转导紊乱。K-ras基因在第12位 密码子发生点突变。(2)基因过表达。由基因扩增(如肺癌中的K-ras基因扩增)或转录增强引起。(3)基因插入、转位。可导致基因有过表达而活化。Ras基因激活导致ras-P21过量生成,持续将生长信号传入细胞内,造成细胞转化或恶变。K-ras基因突变率越高,肿瘤进展越快。

  在K-ras信号转导途径中,外显子1在密码子12或61发生点突变,产生突变的ras蛋白与GTP结合牢固,中断GTP与GDP循环,给细胞生长传递连续的有丝分裂信号,使细胞从分化状态转为增殖状态,活化的ras蛋白还延长了细胞表面酪氨酸激酶生长因子受体信号存在时间,促进细胞增殖,从而引起肺癌。但在许多氡暴露致肺癌的流行病学调查中都未发现K-ras基因的突变,此过程可能缺乏突变的ras蛋白介导。

  三、p16基因

  p16基因是一种抑癌基因,位于9p21,全长8.5kb,由2个内含子间隔3个外显子组成,编码相对分子质量为16000的核磷蛋白p16。该蛋白包含一个148个氨基酸的开放阅读框架,并由4个回钩状重复序列组成其空间构型。这一构型为维持p16活性所必需。p16是CDK4和CDK6的抑制剂。p16的主要作用在于能够抑制CDK4/CDK6介导的Rb基因蛋白产物的磷酸化。磷酸化的Rb则无活性。在G1期,Cyclin D-CDK4复合物具有激酶活力,促进Rb的磷酸化。而p16与Cyclin D竞争结合CDK4,从而抑制Rb磷酸化,阻止细胞从G1期进入S期。正常情况下,G1期CDK活性的增加使Rb失活,导致E2F过度表达,并诱导p16相关的转录活动。因此,p16与Cyclin D、CDK4、Rb形成一个反馈调节环路。p16的失活将导致细胞的过度增殖。

  p16点突变较常见于各种类型的癌症中。在氡暴露致肺癌的过程中,p16肿瘤抑制基因的失活和甲基化起着重要作用。Gilliland等对70名铀矿工的外周血淋巴细胞DNA用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法进行了NADPH醌氧化还原酶(NQO)、髓过氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)GSTP1、GSTM及XRCC1基因多态性分析,并对从细胞中分离的DNA 用甲基化特异性PCR法分析p16的甲基化,发现GSTP1和104bpA至G位点的多态性增加了p16甲基化的危险(OR=4.8,95%CI=1.3~14.2)。

  四、O6-MGMT基因

  人MGMT(hMGMT)基因位于第10号染色体26q上,含有5个外显因子、4个内含子。碱基组成比例为:A174、C231、G271、T159。启动子区富含G、C碱基,MGMT增强子结合蛋白(MEBP)与MGMT的增强子结合,上调MGMT表达。MGMT有基因多态现象。从大肠菌群到人类细胞系均发现有MGMT蛋白,为单肽结构。MGMT是DNA修复酶,它是嘌呤甲基化修复的限速酶。从严格意义上说它不属于酶类,因为它的活力部位上的Cys145与底物上的甲基结合后就失去了活力,是不可逆反应。O6mG上的甲基被转走后恢复为G。hMGMT主要转移O6-甲基鸟嘌呤(O6mG)上的甲基,对其他甲基化的碱基如O6乙基鸟嘌呤、O6丁基鸟嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶的转移活力及转移效率均较低。

  MGMT基因是DNA修复基因。在氡暴露致肺癌的过程中MGMT基因甲基化起着重要作用。Gilliland等在对70名铀矿工的外周血淋巴细胞DNA用PCR-RFLP法进行的同一研究中发现,GSTP1在104bpA至G位点的多态性增加了MGMT甲基化的危险(OR=4.8,95%CI=1.2~18.6)。

  五、hprt基因

  人和啮齿类动物细胞的hprt基因位于X染色体长臂远端区域,其编码产生的酶参与细胞内嘌呤补救代谢途径,如缺乏或活力降低会引起核酸代谢异常。Hprt基因在功能上是半合子,发生突变即可表现出来。Hprt基因位点突变对电离辐射非常敏感,突变的细胞能在含6-硫鸟嘌呤(6-TG)的培养基中生长,细胞在体内外都能耐受hprt突变,因此,hprt基因是研究理化因素所致DNA损伤和人体远后效应较为理想的靶基因。

  Cole等用细胞克隆法观察室内氡浓度为19~484Bq/m3的居民外周血T淋巴细胞hprt基因突变,未发现hprt的突变率与居室氡的暴露水平有明显的相关。Shanahan等在研究澳大利亚南部铀矿工人外周血中hprt突变率时发现,当氡的累积暴露量>10WLM(working level months)时,hprt的突变率没有随着暴露量的增加而增加。Ruttenber等在对有关居室氡暴露与hprt基因突变频率关系的7项研究重新分析后发现,hprt基因突变频率不能作为居室氡暴露的生物标志物。

  六、其他基因

  细胞遗传学研究发现,氡致染色体的操作和缺失作用发生在第8和14条染色体上。肿瘤细胞的产生系第8条染色体大片段缺失频率发生造成,可能是因为多种肿瘤抑制基因存在于第8条染色体上,并且这些基因在肿瘤的发生中具有选择性。类似肿瘤抑制基因、血小板来源的生长因子受体β就是一个定位于8p21.3~p22的可能的候选基因。另外,R30-5B细胞系8q22~q24区域的缺失为寻找含有肿瘤抑制基因最小片段提供了一种新的思路。8q22~q24区域包含了好几个候选肿瘤抑制基因。这些基因可能包括细胞周期素D相关核结合因子α亚单位2、促甲状腺激素释放激素受体、纤维结合素、细胞黏合素相关的粗纤维调节素、丙酮酸谷氨酰胺氨基转移酶、PTK2蛋白酪氨酸激酶和腺苷酰环化酶8。第14条染色体的缺失部位已定在0.5~1.7cmol(厘摩尔),该染色体的杂合性缺失(LOH)区段含有几种肿瘤抑制基因,可能位于14q12~q13区段的是CCAAT/增强子编码蛋白V、谷氨酰胺转移酶1、成对的同源基因9、脱嘌呤核酸和脱嘧啶核酸内切酶和生长抑制素受体1。另一个感兴趣区域位于14q21~q23,包含有细胞周期素依赖性激酶抑制剂3、myc相关因子X和转化生长因子β3。对这些染色体区域更深入、细致的研究将有助于找出人类支气管上皮的肿瘤抑制基因。这两条染色体上含有多种肿瘤抑制基因的缺失位点。可见,氡致染色体的操作和缺失作用,具有多区段、多位点的特征,提示为多基因而不是单基因的改变。

感动 同情 无聊 愤怒 搞笑 难过 高兴 路过

责任编辑 :forest (易 安 网 版 权 所 有 ,未 经 授 权 禁 止 使 用 ,不 能 转 载 ! )

分享按钮